Interruptores moleculares e a diversidade das espécies

François Jacob, um dos cientistas que construíram o primeiro modelo explicativo da regulação da transcrição, disse em uma de suas entrevistas que, quando iniciou sua carreira em biologia, nos anos 1950, a ideia predominante para explicar essas diferenças era de que as moléculas de um organismo eram diferentes das moléculas de outro organismo. Por exemplo, “vacas teriam moléculas de vacas, cabras teriam moléculas de cabras e cobras teriam moléculas de cobras”. 

Aos poucos, com o conhecimento das moléculas de diferentes espécies, foi ficando claro que havia muito mais similaridade do que se imaginava. De fato, moléculas exclusivas (codificadas por genes espécie-específicos) eram a exceção e não a regra. Mas se as espécies compartilham as mesmas moléculas, como explicar a grande diversidade morfológica, fisiológica e comportamental encontrada em diferentes espécies? Essa mesma pergunta foi feita há mais de 35 anos por Allan Charles Wilson e sua então aluna de doutorado, Mary-Claire King. Ao comparar proteínas isoladas de chimpanzés (Pan troglodytes) e de humanos (Homo sapiens), King e Wilson mostraram que a divergência observada entre as duas espécies era mínima. Uma diferença tão baixa entre as proteínas seria insuficiente para explicar a extensa diferença morfofisiológica entre as espécies. King e Wilson então sugeriram que grande parte da diversidade das espécies seria um resultado de mudanças na expressão gênica e não em variações na função dos produtos gênicos.

O paradoxo da conservação de estrutura e função de genes frente à diversidade morfológica ficou ainda mais evidente com a surpreendente descoberta de que a maioria dos animais compartilhava várias famílias de genes envolvidos no estabelecimento do padrão corporal. Por exemplo, o gene Pax6 é encontrado em inúmeras espécies animais e é extremamente conservado. Comparando as sequencias de aminoácidos do PAX6 de camundongos com o seu homólogo no peixe paulistinha, Danio rerio, há uma identidade de 97%. A mesma comparação feita entre os homólogos de humanos e da mosquinha do vinagre, Drosophila melanogaster, revela uma identidade de 94%, ou seja, de cada 100 aminoácidos na sequência da proteína PAX6 humana, 94 são idênticas à proteína homóloga de D. melanogaster (em Drosophila, o gene recebe o nome de eyeless).

A proteína PAX6 é um dos fatores de transcrição que induzem diferenciação durante o desenvolvimento do embrião. Em resposta a gradientes de outras proteínas regulatórias, esses fatores de transcrição se ligam a sequências de DNA específicas próximas a outros genes e regulam sua expressão, ou seja, a produção de RNA mensageiro. Fatores de transcrição determinam quando, onde e quanto um determinado gene será expresso. Funcionam como interruptores, ligando e desligando os genes em resposta a diferentes estímulos. Durante o desenvolvimento, eles determinam a posição e destino das células embrionárias. PAX6 é o principal interruptor no controle do desenvolvimento dos olhos de várias espécies. Indivíduos de D. melanogaster mutantes para o gene eyeless não possuem olhos (Figura 1). Mutações no gene Pax6 em humanos causam aniridia, uma condição genética caracterizada pela ausência de íris. Com o estudo deste e de outros genes conservados em várias espécies diferentes, passamos a nos perguntar: se os organismos compartilham genes com função e estrutura tão parecidas, como explicar o aparecimento de características tão distintas?

Figura 1. Apesar da diferença morfológica dos olhos de diferentes animais, o desenvolvimento é iniciado por um gene “regulador mestre” – Pax6 (eyeless na mosca). Mutações nos genes Pax6 ou eyeless causam defeitos importantes na formação do olho. (A) Pax6 é necessário para o desenvolvimento normal de olhos humanos. Pessoas com mutação no gene Pax6 não apresentam desenvolvimento da íris, uma condição genética chamada de aniridia. (B) em camundongos, os mutantes apresentam microftalmia extrema e anormalidades no desenvolvimento de lentes e íris. (C) no peixe paulistinha, os mutantes apresentam tamanho reduzido dos olhos e das lentes e má formação da retina. (D) o desenvolvimento dos olhos compostos da mosca também requer o funcionamento normal do homólogo de Pax6, o gene eyeless. O resultado da mutação é a ausência de olhos nas moscas adultas (Adaptado de Washington et al, 2009).

O padrão de expressão de um gene (quando, onde e quanto ele é expresso) é tão importante quanto a própria função de seu produto final e, por isso, mudanças neste padrão podem causar importantes diferenças fenotípicas. Mudanças na expressão gênica ocorrem de inúmeras formas distintas, incluindo mudanças na conformação da cromatina (como veremos a seguir) e mudanças em sequências regulatórias. Em geral, as regiões regulatórias são classificadas de acordo com a distância relativa dos genes que regulam. Regiões regulatórias em trans são aquelas que regulam genes distantes. Uma mutação no próprio fator de transcrição (como o Pax6, por exemplo), pode alterar sua ligação a um elemento de DNA em genes distantes. Outras alterações envolvem mutações em regiões regulatórias na vizinhança dos genes que regulam (com ação em cis). Mutações nessas regiões, podem destruir ou criar novos sítios de ligação de fatores de transcrição ou ativadores.

Uma distinção importante entre variações em regiões codificantes e regulatórias é que a primeira delas, em geral, altera a função do produto gênico, enquanto que a segunda altera seu padrão espacial e temporal de expressão. Como muitos genes têm uma ação pleiotrópica, a alteração de sua função por meio de mutações na região codificante pode afetar simultaneamente várias vias metabólicas e afetar diferentes funções vitais. Este efeito pleiotrópico é minimizado quando a mutação ocorre em regiões cis-regulatórias, onde ligam-se os fatores de transcrição que ligam e desligam genes de uma forma contexto-dependente. Cada gene pode conter vários módulos cis-regulatórios, o que permite que um mesmo gene seja regulado por diferentes fatores de transcrição. Assim, uma mutação em um módulo pode passar despercebida em um tecido e causar grandes alterações em outros tecidos do mesmo organismo. Por exemplo, o esgana-gata, Gasterosteus aculeatus, é um peixe pequeno com distribuição em diversos ambientes, tanto lacustres, como marinhos. Ao longo dos últimos 10 a 20 mil anos, peixinhos de diferentes populações lacustres perderam os espinhos pélvicos. Shapiro e colaboradores descobriram importantes diferenças na sequência regulatória do gene pitx1. Essas diferenças eram responsáveis pela perda do espinho. A observação mais surpreendente, no entanto, foi a de que esse gene tem um papel importante no desenvolvimento embrionário de vertebrados, e um peixe sem a proteína PITX1 funcional não é viável. A mutação identificada afetava apenas o desenvolvimento da região pélvica, pois a perda do espinho foi o resultado de deleções de um módulo cis-regulatório que controla a expressão de pitx1 apenas na região pélvica no alevino, não havendo nenhuma alteração da expressão do gene em outros tecidos (Figura 2A). O espinho está presente em todas as populações marinhas do esgana-gata, enquanto que nas populações lacustres, houve uma redução ou perda completa do espinho. Em ambientes marinhos, o esgana-gata é predado por peixes maiores e o espinho oferece um modo de defesa frente a predadores, enquanto que, nos lagos, os principais predadores são os insetos, que agarram o esgana-gata pelo espinho. Esse cenário sugere que a fixação do traço (ausência do espinho pélvico) nas populações lacustres possa ser uma resposta adaptativa.

Figura 2. Evolução do espinho pélvico em esgana-gata. A redução ou perda do espinho pélvico é resultado de mutações que levaram a perdas recorrentes de um módulo cis-regulatório que controla a expressão do gene pitx1. Sem o elemento regulatório, não há expressão de pitx1 na pelve e, consequentemente, não há desenvolvimento do espinho (Meyer e Torres, 2017).

Outro exemplo clássico de como variações na expressão gênica resultam em variações morfológicas vem dos tentilhões de Darwin. Essas espécies são muito parecidas em seu tamanho, forma e coloração, mas a forma e o tamanho dos bicos mostram uma variação substancial entre as diferentes espécies (Figura 3). A diversidade de forma dos bicos resulta diretamente na variedade de alimentos que essas aves podem explorar, desde sementes até pequenos insetos. Abzhanov e colaboradores mostraram que a alteração no nível de expressão de duas proteínas, BMP4 (bone morphogenetic protein 4) e Calmodulina, levavam, respectivamente, a uma alteração na forma e no tamanho do bico de algumas espécies (Figura 3). Em seis espécies de tentilhões do gênero Geospiza, a proteína BMP4 é expressa em níveis mais altos nos bicos mais robustos (com altura maior). Já a calmodulina é expressa em altos níveis em bicos longos. A variação na expressão desses genes tem um efeito direto na diversidade morfológica do bico, fornecendo o material bruto para seleção natural.

Figura 3. As diferentes morfologias do bico em Geospiza são resultantes de variações na expressão espacial e temporal de diferentes genes. Espécies com maior altura do bico como G. magnirostris e G. fortis apresentam expressão precoce e espacialmente distribuída de BMP4, TGFβIIr, β-catenin, e Dkk3, enquanto que em espécies com bicos mais longos, como G. conirostris e G. scandens, a expressão de Calmodulina, TGFβIIr, β-catenina, e Dkk3 é localizada na porção distal do bico (Meyer e Torres, 2017).

Essa fina regulação da expressão dos genes, dependente das regiões regulatórias, pode ser uma das explicações para a complexidade de formas, tamanhos e funções dos animais. O DNA genômico de eucariotos forma um complexo (cromatina) com proteínas chamadas histonas. Algumas modificações nessas proteínas resultam na descompactação da cromatina, o que permite o acesso da maquinaria de transcrição a seus sítios de ligação do DNA. Outros tipos de modificação resultam na compactação da cromatina e repressão da expressão. As alterações na cromatina representam mais um nível de regulação da expressão gênica em eucariotos e, até recentemente, pouco de sabia sobre as origens desse mecanismo de controle. Federico Gaiti e colegas descreveram que o sistema de regulação necessário para o desenvolvimento de animais multicelulares complexos já estava presente na esponja Amphimedon queenslandica. Evidências indicam que as características comuns entre esponjas e os outros animais estavam presentes no ancestral de todos animais, já que esses grupos divergiram logo após o surgimento de Metazoa (Figura 4). No trabalho, os pesquisadores buscaram formas de regulação da expressão identificados anteriormente em outros animais e encontraram evidência da ocorrência dos mesmos mecanismos em Amphimedon, incluindo mudanças na conformação da cromatina e elementos cis-regulatórios distais — sítios de ligação de proteínas que aumentam a transcrição dos genes (Figura 4). Esses elementos são compartilhados por todos os animais, mas estão ausentes em espécies unicelulares relacionadas, fornecendo mais uma evidência de que a complexidade na regulação gênica foi fundamental para e a evolução da multicelularidade e das diversas formas e funções animais.

Figura 4. (A) O DNA genômico em células eucarióticas é associado a histonas. Não há expressão quando há compactação da cromatina. Além dos genes (azul), o DNA contém elementos cis-regulatórios, como promotores (amarelo) e ativadores (vermelho), (B) Relações filogenéticas de bilateria, eumetazoa e choanoflagellata (esquerda), como os mecanismos de regulação da expressão gênica observados em cada grupo (direira). Todos os animais (metazoa) tornam-se adultos multicelulares, o que os distingue de organismos celulares relacionados. Bilateria, como D. melanogaster, apresenta vários mecanismos de regulação que não são observados em espécies unicelulares. Algumas dessas características foram recentemente observadas na esponja A. queenslandica (Adaptado de Hinman e Cary, 2017).

Tatiana Teixeira Torres (USP)

Para saber mais:

Meyer D, Torres TT (2017) Evolução de Genes e Genomas. Em: Carlos F. M. Menck; Marie-Anne Van Sluys (Org.) Genética Molecular Básica | Dos Genes aos Genomas. São Paulo: GEN | Grupo Editorial Nacional, 500p.

Romero IG, Ruvinsky I, Gilad Y (2012) Comparative studies of gene expression and the evolution of gene regulation. Nature Reviews Genetics, 13: 505–516.